随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
数据分析：实时荧光检测装置会记录并收集PCR反应过程中的荧光信号强度。通过荧光信号的变化，可以确定PCR产物的累积量，并通过标准曲线或其他方法计算目标基因的拷贝数目。qPCR的优点在于其高灵敏度、高特异性和广泛的动态范围。它可以用于许多应用，如基因表达分析、病原体检测、拷贝数变异检测等。
Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。
引起Duplication的主要原因是在测序中有PCR过程，来源于同一个DNA片段PCR的产物被重复测序，就会产生duplication。
在利用DNA样本进行文库构建过程中有几个考虑，包括起始材料的量以及该文库是用于重测序（有可用于比对的参考序列）还是从头测序（需要利用此次下机数据组装出新的参考序列）。
针对测序建库不合格的情况，可以考虑以下几个处理方法： 重新建库：如果质控结果显示建库不合格，可能是操作过程中出现了问题，可以尝试重新进行建库操作，确保所有步骤都按照操作流程进行。 优化建库方案：如果重复建库仍然出现不合格的情况，可以尝试优化建库方案。
二代测序建库浓度低的原因如下：样本质量：样本质量直接影响建库浓度。如果样本DNA含量较低、质量较差或者降解严重，那么在建库过程中可能会导致浓度低。PCR扩增效果：PCR扩增是建库过程中的一个关键步骤，扩增效果会直接影响建库浓度。如果PCR扩增不足或扩增效果不佳，都可能导致建库浓度低。
要搞清楚这个read重复（duplicate）的问题，我想我们需要从NGS数据的产出过程说起，具体来说如下： 我们一般认为第1步DNA提取出来的是完整的基因组，打断则是完全随机的——通常来说也确实如此。
生物组织中的DNA经过怎样的“洗礼”，最终在芯片上被“认可”……一 测序文库 即DNA片段的一个集合，将DNA序列打断后即构成一个文库（提取出的DNA需经过一系列操作才能用于测序）。打断 DNA打断方式：机械法，超声波法和酶切法。
1、事实上，我们在所有qPCR数据分析中使用GenEx。GenEx强大、用户友好，且支持所有领先的qPCR仪器，这让从实验中导入数据和注释很简单。GenEx有着卓越的数据质量评估，对单细胞研究很重要，以及强大的单细胞表达谱工具。它有着用户友好的界面，即使是没有经验的用户也能使用那些强大的工具。
2、rRNA和真核生物的28s或actin。不过，我们也注意到，这些常用参考基因的表达水平在单细胞中也差别很大，对大量细胞qPCR的标准定量法则也须特别谨慎。在大部分情况下，我们报告原始和均一化的Ct值，并使用它们进行单细胞qPCR结果的定量。
3、【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数Thresholdcycle（Ct）也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。
4、数据分析：根据miRNA扩增的结果，进行数据分析和解释。对于qPCR，常使用相对定量方法或绝对定量方法（如标准曲线法）来分析miRNA的表达水平。对于芯片和测序数据，可以使用不同的生物信息学工具进行差异表达分析、富集分析等。miRNA检测的方法会根据实验目的和样品类型而有所不同。
5、数据分析：对实验得到的数据进行分析，以验证生物信息学分析的预测。这可能涉及统计分析、图像处理、数据解读等。整合生信与实验数据：将实验数据与生物信息学分析结果相结合，形成一个统一的结论。这可能需要对比分析、数据挖掘或建模等方法。
